一般的光學顯微鏡利用可見光和玻璃透鏡成像，無法呈現小於約200奈米（0.2微米）的細節。一奈米是一公尺的十億分之一，一微米是一公尺的百萬分之一。這個極限來自光作為波動的特性，數值只是概略值。

大小

這個極限限制的是解析度，也就是顯微鏡仍能區分兩點的最短距離。距離小於這個極限的兩點會模糊成一點。這個極限與放大倍率無關；超過約1000倍後，繼續放大影像只會讓影像變大，不會顯示更多細節。

1873年，顯微鏡學家恩斯特·阿貝發表了一個方程式，顯示解析度取決於光的波長，在最理想的情況下，解析度約為波長的一半。常見的計算方式，是把波長除以數值孔徑的兩倍；數值孔徑是衡量透鏡收光能力的數值。

最好的透鏡透過一滴油觀察，數值孔徑可達約1.4。使用波長550奈米的綠光時，這類透鏡能分辨相距約0.2微米的細節；使用波長700奈米的紅光時，同樣的計算會得到較粗的極限，而使用紫光時則會得到較精細的極限。

大小比較

這個極限限制的是細節，而不是能不能偵測到東西。只要一個會發光的分子，與其他發光分子相距超過0.2微米，就能在一般顯微鏡下顯示成一個光點。這個光點會模糊成極限大小，因此只能顯示分子的位置，看不出它的形狀。

波長越短，能呈現的細節越精細。使用近紫外光的顯微鏡，能分辨的細節比使用可見光的顯微鏡更細小。電子顯微鏡則更進一步：它所使用的電子，表現得像波長約0.005奈米的波，遠短於光的波長。

在20世紀的大半時間裡，科學家都認為光學顯微鏡永遠無法顯示小於約0.2微米的東西。斯特凡·赫爾在1994年提出了一種突破這個極限的方法，並在2000年證實可行。他的方法先用一道光脈衝讓分子發光，再用第二道環形雷射光束，把除了一個微小光點以外、其餘所有發光的分子都關閉。

威廉·莫爾納和艾力克·貝齊格則發展出另一種方法，每次只讓少數幾個分子發光，再把許多影像組合起來。3人因「開發超高解析度螢光顯微技術」，共同獲得2014年諾貝爾化學獎。頒獎的瑞典皇家科學院表示，他們的成就讓「顯微術變成了奈米顯微術」。

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